illumina DNA測(cè)序儀常見故障維修分析：您將在下面找到一些與 DNA 測(cè)序相關(guān)的常見問題以及這些問題的可能原因和解決方案。在描述問題、如何識(shí)別問題、原因和問題的潛在解決方案的信息上方顯示了序列跟蹤的圖片。序列數(shù)據(jù)可能會(huì)出現(xiàn)其他問題，但下面列出的是常見的問題。

1、illumina DNA測(cè)序儀壓縮順序問題維修：

序列顯示為多個(gè)重疊軌跡，并不總是貫穿整個(gè)序列

如何識(shí)別：序列數(shù)據(jù)在序列中的一個(gè)點(diǎn)之后開始顯示多個(gè)重疊跡線，盡管測(cè)序信號(hào)仍然很強(qiáng)。壓縮現(xiàn)象和受污染的illumina DNA 制備物可能看起來相似，但受污染的制備物通常會(huì)在插入克隆位點(diǎn)后立即顯示重疊痕跡。

原因：具有相同電泳遷移率的不同大小的 DNA 片段，即在電泳過程中在彼此頂部遷移的片段。這種現(xiàn)象被認(rèn)為是由模板 DNA 中的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域引起的，這些區(qū)域通常但不總是出現(xiàn)在具有高 G/C 或高 A/T 含量的區(qū)域。

解決方案：

將 DMSO 添加到illumina測(cè)序反應(yīng)的 5% (v/v) 濃度。在循環(huán)測(cè)序前將反應(yīng)在 96°C 下孵育 10 分鐘。循環(huán)前將所有反應(yīng)組分加倍并在 98C 下孵育 10 分鐘。（注意：反應(yīng)組分加倍以說明因較高的變性溫度而失活的酶量。使用測(cè)序試劑稀釋緩沖液時(shí)不要使用此溶液）用限制酶線性化質(zhì)粒。如果樣品是 PCR 產(chǎn)物，嘗試用 7-deaza-dGTP 代替 PCR 中 75% 的 dGTP 擴(kuò)增 DNA，然后對(duì)illumina PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。選擇靠近壓縮位點(diǎn)的新引物，這有助于避免二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

2、illumina DNA測(cè)序儀污染質(zhì)粒 DNA 的制備問題維修：

污染的質(zhì)粒 DNA 制備導(dǎo)致序列數(shù)據(jù)中的重疊峰。

如何識(shí)別：序列數(shù)據(jù)清楚地顯示到插入克隆位點(diǎn)的末尾，在這一點(diǎn)上，通?？梢钥吹狡渌逑路降姆?。在壞的情況下，峰會(huì)相互遮擋，使整個(gè)序列無法讀取。

原因：為單個(gè)質(zhì)粒制備挑選多個(gè)克隆，或挑選包含兩個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒的單個(gè)菌落，每個(gè)質(zhì)粒都有不同的插入片段。

解決方案：在干凈的環(huán)境中小心地從您的平板中挑選一個(gè)菌落到您的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在 DNA 制備后，通過限制性消化和瓊脂糖凝膠分析驗(yàn)證您的單個(gè)菌落是否包含您感興趣的插入片段。